免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)实验

简要描述：

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)实验是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相免疫共沉淀互作用被保留了下来。

更新时间：2024-07-26

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产品介绍

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)实验

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)实验流程：

样品准备

将不同分组的细胞从培养箱中取出（每组2个10cm的皿），在冰上用预冷的PBS洗一遍，加入裂解液（20mM Tris-HCL Ph7.5、150 mM Nacl、1%TritonX-100、1 mM EDTA和蛋白酶抑制剂），用细胞刮裂解细胞。13000rpm 4℃离心10min，去上清进行蛋白定量。定量后原液备用。

蛋白定量

1 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂

孔号	1	2	3	4	5	6	7	8
蛋白标准液（μl）	0	2	4	6	8	12	16	20
去离子水（μl）	20	18	16	14	12	8	4	0
蛋白浓度（μg/μl）	0	0.05	0.1	0.15	0.2	0.3	0.4	0.5

2. 根据样品数量，将BCA试剂A与试剂B按体积比为50:1配制适量BCA工作液，充分混匀；

3. 各孔加入160μl BCA工作液；

4. 把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下测定吸光度。以吸光值为横坐标，蛋白浓度（μg/μl）为纵坐标，绘出标准曲线；

5. 在酶标板中加入2μl待测蛋白和18μl PBS（稀释10倍），加入160μl BCA工作液，把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下测定吸光度。

6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白浓度（μg/μl），乘以样品稀释倍数（10）即为样品实际浓度（单位：μg /μl）。

共沉淀
根据蛋白定量结果，将各组蛋白留取适量用于做input对照；
分别取各组细胞蛋白置于2个1.5ml离心管中（2mg每管），其中一个加入2ug IgG，另外一个加入2ug IP指标对应的抗体，冰上孵育2h；
分别向两个管子中加入protein G-Agarose beads（Roche），加裂解液至1ml。4℃旋转混匀，孵育过夜；
2500rpm，4℃离心1min，去上清，1ml裂解液洗涤沉淀4次；
加入2×蛋白上样缓冲液，轻轻混匀后煮沸5min，2500rpm离心1min，弃沉淀；
将上清转移至新的离心管中，用于western blot检测相应蛋白。
PAGE胶的制备

1. 下层分离胶的制备

根据目的蛋白的分子量选择不同的凝胶浓度，高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。 GRα 90kDa AP-1 43.48kDa IkB 39kDa STAT3 79， 86kDa NF-KB p65 故选用10%的胶。不同浓度的分离胶按下表进行配制，待下层胶凝固后进行上次浓缩胶的配制。

2. 上层浓缩胶的配制

根据需要按下表配制浓缩胶，并插好梳子。

上样及电泳

1. 上样

每孔上样量约为20ul蛋白，可以根据实验要求加大上样量。将配制好的PAGE胶放入电泳槽中，加入适量电泳缓冲液，取下梳子用枪轻轻吹打加样孔，避免孔内有余胶残留影响上样。将准备好的样品用加样枪慢慢加到对应的孔内，注意勿溢出加样孔。

2. 电泳

一般浓缩胶80V 20分钟，分离胶120V 60分钟，可以根据具体实验要求调整电压和时间。当染料到达胶底部时切断电源，停止电泳，进行下一步转膜。

转膜

转膜分为湿转和半干转，本实验室选用半干转。

半干式转膜中，三明治的排列为：/虑纸/胶/膜/虑纸，用电转缓冲液浸湿后，直接置于电转仪的正负极之间。胶于负极而膜置于正极。半干式的电转缓冲液不同于湿式的电转缓冲液，推荐为：48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇。25V转膜30分钟即可。转膜前将PVDF膜在甲醇中浸泡1-2 分钟（NC膜在电转液中浸泡10-20分钟），再孵育于冰冷的电转缓冲液中5 分钟，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡3-5 分钟，否则转膜时会导致条带变形。